描述：甘油是甘油三酯水解产生的重要成分。作为游离脂肪酸的代谢产物，甘油含量是评估甘油三酯水解反应的关键指标，并且其检测过程非常简便。本试剂盒经过优化，能够有效地检测实体组织和细胞中的甘油含量，线性范围为10-1200µmol/L。

原理：在ATP的存在下，甘油首先被甘油激酶磷酸化为3-磷酸甘油，随后经过甘油磷酸氧化酶的作用，转化为过氧化氢。在过氧化物酶的催化下，生色底物被转化为苯亚胺，其光密度值和甘油浓度成正比。

适用范围：本试剂盒适合用于测定各类实体组织及细胞中的甘油浓度。其组成可支持105次微板检测或30次1ml比色杯检测，包含：(1) 脱脂裂解液50ml (2) R1试剂16ml (3) R2试剂4ml (4) 4mmol/L甘油标准品1ml，6个月内在4ºC存储有效。

所需设备：进行本检测需要的设备包括酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。最佳工作波长为550nm，若无该波长可优先选择570nm，次选530nm或490nm。

细胞裂解：对于组织细胞的裂解（包括分化后的脂肪细胞），应当首先消化和离心以收集细胞，或直接在培养皿内进行裂解。常规情况下，在6孔板的单孔中大约使用2x10⁶个细胞，使用75cm²瓶约需1x10⁷个细胞。依据比例，每1~2x10⁶个细胞添加0.1ml裂解液，震荡或涡旋混合后，静置10分钟。

动物组织裂解：注意事先将新鲜组织剪切并称重后再进行保存。组织若在冷冻后再解冻和剪切，可能会导致严重的测量误差。采用减量称重法，首先在离心管内精确称重，加入组织块后再称重，两者相减以计算组织重量（约100mg）。强烈建议每1mg组织添加10µl裂解液，减少样品间蛋白和脂质含量的变异引起的误差。应使用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器来破碎组织，而不推荐超声波方法（因其不能完全和均匀破碎）。根据预实验调整初始组织细胞的添加量后，再静置10分钟。

裂解液处理：取适量的上清液转移至15ml离心管，进行后续操作。剩余的裂解液可应用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量或储存于-20ºC。270ºC加热10分钟以灭活脂肪酶，此过程可能出现絮状沉淀。随后，在室温5000rpm离心5分钟，上层清液可用于酶学测定。

工作溶液配制：按4:1比例混合4ml试剂R1与1ml试剂R2，即可制得工作溶液，立即使用或在4ºC保存不超过1天。注意防止来源不明的甘油污染，污染源可能来自操作人员或标准品液体的微粒溅射。

标准品稀释：利用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液相同的液体，将4mM甘油标准品稀释为1000、500、250、125、625、3125和15625µmol/L，通常选择其中的4~6管，并设置0浓度对照反应管。

甘油测定：根据下表加样，待测样品体积为10µl，多加可能会抑制反应。反应在237ºC或25ºC下进行10分钟，反应结束后，颜色将在60分钟内保持稳定。首先用蒸馏水和工作液组成的空白管进行调零，然后测定各管的OD值。最后，绘制标准曲线并计算甘油浓度。附加Excel作图步骤：以各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。方法为：选中数据，点击图表向导，选择散点图，完成后右键点击图上的某一点，添加趋势线，显示公式和R²值。

最终，须依据每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。这一方法确保了结果的精确性，非常适合在生物医疗领域的相关研究与应用中使用，尊龙凯时提供的试剂盒将帮助您有效获得准确的甘油检测结果。